纯镁微弧氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠载铜膜层的 细胞相容性及抑菌性分析论文
导读:目的: 分析纯镁微弧氧化 - 壳聚糖 海藻酸钠载铜膜层的细胞相容性及抑菌性。方法: 以纯度为 99 9% 的镁片制作 20 片 试件,分为 4 组各 5 片,甲组表面为纯镁微弧氧化层,乙组为纯镁微弧氧
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【摘要】 目的: 分析纯镁微弧氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠载铜膜层的细胞相容性及抑菌性。方法: 以纯度为 99.9% 的镁片制作 20 片 试件,分为 4 组各 5 片,甲组表面为纯镁微弧氧化层,乙组为纯镁微弧氧化 - 壳聚糖复合膜层,丙组为纯镁微弧氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠 膜层,丁组为纯镁微弧氧化 - 壳聚糖/ 海藻酸钠载铜膜层, 比较四组试件的显微形态、湿润角、细胞相容性及抑菌性。 结果: 试件表面微孔、 裂纹数量, 甲组 > 乙组 > 丙组 > 丁组;细胞铺展面积, 丁组 > 丙组 > 乙组 > 甲组;各组试件的湿润角比较, 差异无统计学意义(P>0.05); 在大肠埃希菌培养液中培养 24 h 后,菌落数甲组 > 乙组 > 丙组 > 丁组,抑菌性丁组 > 丙组 > 乙组,差异均有统计学意义(P<0.05) 。 结论: 纯镁微弧氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠载铜膜层可有效封闭镁片表面微孔,且细胞相容性、抑菌性良好,效果优于纯镁微弧氧化层、纯 镁微弧氧化 - 壳聚糖复合膜层及纯镁微弧氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠膜层。
【关键词】 纯镁材料;微弧氧化;壳聚糖;海藻酸钠;铜膜层;抑菌性;细胞相容性
Analysis of cell compatibility and antibacterial activity of micro-arc oxidized pure Magnesium-chitosan/sodium alginate containing copper composite film
WANG Jingang1, YU Tingting2*
(1. Department of Oral and Maxillofacial Surgery of the Central Hospital of Jiamusi City, Jiamusi 154002 Heilongjiang, China;
2. Department of Prosthodontics of Stomatological Hospital of the Second Affiliated Hospital ofJiamusi University, Jiamusi 154002 Heilongjiang, China)
【Key words】 Pure magnesium material; Micro-arc oxidation; Chitosan; Sodium alginate; Copper film layer; Antibacterial activity; Cell compatibility
纯镁是新型口腔种植材料,其密度和弹性模量 接近人体骨质,但不耐腐蚀,生物相容性差,需要进行表面处理以提高其生物性能。微弧氧化技术是 通过高温高压处理,使金属表面产生类似陶瓷的致 密氧化膜的技术 [1] ;而壳聚糖、海藻酸钠属于有机 材料,装载于纯镁表面可提高其耐腐蚀性和生物相 容性 [2-3] ;铜膜层则是在上述表面处理之后,用化 学方法在试件表面镀铜, 能够覆盖陶瓷膜上的微孔, 密闭性更好,从而起到更好的抑菌效果 [4] 。佳木斯市中心医院口腔颌面外科近年来开始探索纯镁微弧 氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠载铜膜层这一材料的应用 优势。本文比较 4 种涂层对纯镁材料细胞相容性和 抑菌性能的改善效果。
1 资料与方法
1.1 仪器与材料 仪器:激光共聚焦显微镜(德 国卡尔 - 蔡司公司)、MGC-300H 恒温培养箱(上 海一恒科技有限公司)、灭菌锅(山东博科消毒设 备有限公司)、恒温水浴锅(常州市国旺仪器制造 有限公司)、JC2000C 接触角测定仪(上海坤诚科 学仪器有限公司)、双极性脉冲微弧氧化电源(哈 尔滨工业大学)。
试件材料:试件基底材料为纯度99.9% 的镁片, 将之切割为 10 mm×10 mm×1.5 mm 的长方形,共 20 片。
菌株:ATCC25922 大肠埃希菌(宁波泰斯拓 生物技术有限责任公司)、MC3T3-E1 小鼠前成骨 细胞(中科院上海细胞库)。
1.2 方法 (1)试件膜层制作。将镁片试件分为 甲、乙、丙、丁 4 组,每组 5 片。以金刚砂纸打磨 试件表面,以 10% 磷酸、8% 碳酸氢钠溶液依次进 行处理,清除表面沉积物。①甲组为空白对照组, 仅采用超声微弧氧化处理,以纯镁试件作为电源 阳极,装有硅酸盐电解液的不锈钢氧化槽为电源阴 极,微弧脉冲频率为 500 Hz,电压 300 V,辅助超 声的功率为 60 W,电压稳定后行 10 min 微弧氧化 处理, 之后将试件取出, 以蒸馏水冲洗, 晾干。②乙 组为纯镁微弧氧化 - 壳聚糖复合膜层:对纯镁试件 行微弧氧化处理后,用 0.12 mg/L NaOH 溶液浸泡1 h,取出晾干备用。取壳聚糖3 g,加入 1000 mL 1% 乙酸,超声振荡使壳聚糖溶解,将试件在壳聚糖溶 液中浸泡 6 h,使试件表面形成多糖薄膜。③丙组 为纯镁微弧氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠膜层,在乙组 基础上,将镁片试件在 0.15% 海藻酸钠水溶液浸泡
3 min, 取出后, 自然晾干。④丁组为纯镁微弧氧化- 壳聚糖 / 海藻酸钠载铜膜层组,经丙组方法处理 后,将试件放在载铜处理液中。载铜处理液配方:25 g/L NaH2PO4+20 g/L Na3PO4+8 g/L CuSO4 ·5H2O, 于 60℃下,浸泡 5 min,之后取出,将试件表面所 附液体去除,自然晾干。(2)膜层湿润角分析。将蒸馏水滴在试件表面, 用 JC2000c 接触角测量仪测定湿润角, 每组测 3 次, 取平均值。
(3)细胞相容性分析。将小鼠成骨细胞传代 培养 4 代,铺满培养皿的 80% 后,即开始试验。 将试件用酒精浸泡 24 h,蒸馏水冲洗后行紫外线 照射灭菌,重复 3 次。将试件放在 24 孔板底部, 37 ℃下培养 7 d,用 PBS 缓冲液冲洗 3 次,加入 无血清培养液、CCK-8 溶液混匀,继续培养 3 h (37 ℃), 采集上清液, 取酶标仪,在 450 nm 波 长处测定吸光度值。用激光共聚焦显微镜观察细胞 密度、细胞骨架蛋白及细胞形态,以碱性磷酸酶 (ALP)实验观察细胞活性。(4)抑菌性试验。用微量移液枪,将大肠埃 希菌在营养肉汤中稀释 10 倍,接种在培养基上, 恒温恒湿培养 24 h, 至菌落数为 500~1000 个 /mL。 之后将四组试件接种在培养基中,每个试件做 5 个平行组,向试件上滴加细菌稀释液,在恒温箱 中培养 24 h 后取出,以 2 mL 生理盐水进行冲洗, 采集 100 μL 冲洗液,接种于培养基上再次培养 24 h,用自动计数仪检测菌落数。抑菌率 R=(m- n)/m×100%, 其中 m 为空白对照组(甲组)平均 回收的菌落数, n 为其他组平均回收的菌落数。
1.3 观察指标 (1)以显微镜观察四组试件表面 形态、细胞骨架, 以接触角测量仪测量湿润角。(2) 比较四组试件细胞相容性、抑菌试验结果。
1.4 统计学方法 采用 SPSS 20.0 统计学软件处理 数据,计量资料以(x—±s)表示,采用 F 检验,以 P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组试件表面形态比较 显微镜下,甲组表面 呈多孔结构,表面凹凸不平,可见一些细小白色颗粒 和裂纹(图 1A) ;乙组(图 1B)、丙组(图 1C)孔 隙较小,裂纹逐渐消失;丁组表面未见孔隙和裂纹, 可见一层薄膜覆盖,多孔结构不明显(图 1D)。
2.2 各组试件湿润角比较 甲、乙、丙、丁组试 件表面湿润角依次为(69.50±2.36) °、(68.36 ± 4.26) °、(68.05±3.68) °、(67.80±2.77)°, 四 组试 件的 湿润 角比 较,差 异无 统 计学 意义 (F=0.251,P=0.860)。
2.3 各组试件细胞相容性比较 使用显微镜观察小 鼠成骨细胞在试件表面铺展面积,甲组的铺展面积 较小,细胞核相对较小(图 2A) ;乙组的铺展面积 较甲组大, 成束张力丝显著增多, 黏着斑数量增多, 细胞核增大(图 2B) ;丙组细胞铺展面积进一步 增大,细胞多数为长梭形、多边形(图 2C);丁组细胞为多边形,细胞骨架丰富,黏着斑相对较多, 细胞核明显较其他三组都大(图 2D)。
2.4 各组试件抑菌性比较 培养 24 h 后,菌落数 甲组>乙组>丙组>丁组, 抑菌性丁组>丙组>乙组, 差异均有统计学意义( P<0.05)。 见表 1。
3 讨论
纯镁材料行超声微弧氧化处理后,表面可形成 致密氧化镁层,但仍然会出现点蚀,表面在显微镜 下呈多孔形态,通过封孔材料,能够进一步改良其性能 [5] 。壳聚糖、海藻酸钠均是天然多糖类有机材 料,常用来封孔,两者具有很强的可塑性,且成膜 效果良好,壳聚糖本身具有较多正电荷,而海藻酸 钠具有较多负电荷,两者可以紧密结合 [6] 。本研究 结果显示,在显微镜下,甲组表面有多孔结构,乙 组及丙组孔隙较小,丁组表面未见孔隙,可见丁组 镀铜之后,纯镁微弧氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠载铜 膜层的表面最光滑平整。
本研究结果还显示,各组试件表面湿润角差 异无统计学意义,但丁组稍小于其他组,而且在小 鼠成骨细胞培养液中,丁组细胞铺展面积最大。分 析原因为,湿润角可影响细胞在试件上的亲附能 力。甲组膜层由共价键、氢键等维系,表面张力相 对较大,乙组、丙组中海藻酸钠、壳聚糖的存在, 可使膜层表面张力减小,丁组载铜之后,试件的表 面张力更小,更有利于细胞亲附,因此细胞相容性 最好 [7]。抑菌性试验结果显示,在大肠埃希菌培养液 中培养 24 h 后,菌落数甲组 > 乙组 > 丙组 > 丁组, 抑菌性丁组 > 丙组 > 乙组,可见丁组的抑菌效果最 好。这可能是因为,铜离子本身有一定抗菌效果, 而且铜膜层更致密、光滑,封闭性更好,因此其抑 菌效果优于其他材料 [8]。
综上所述,纯镁微弧氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠 载铜膜层可有效封闭镁片表面微孔, 且细胞相容性、 抑菌性良好,效果优于纯镁微弧氧化层、纯镁微弧 氧化 - 壳聚糖复合膜层及纯镁微弧氧化- 壳聚糖 / 海藻酸钠膜层。
参考文献
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