纯镁微弧氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠载铜膜层的 细胞相容性及抑菌性分析论文

导读:目的: 分析纯镁微弧氧化 - 壳聚糖 海藻酸钠载铜膜层的细胞相容性及抑菌性。方法: 以纯度为 99 9% 的镁片制作 20 片 试件,分为 4 组各 5 片,甲组表面为纯镁微弧氧化层,乙组为纯镁微弧氧

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【摘要】 目的: 分析纯镁微弧氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠载铜膜层的细胞相容性及抑菌性。方法: 以纯度为 99.9% 的镁片制作 20 片 试件,分为 4 组各 5 片,甲组表面为纯镁微弧氧化层,乙组为纯镁微弧氧化 - 壳聚糖复合膜层,丙组为纯镁微弧氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠 膜层,丁组为纯镁微弧氧化 - 壳聚糖/ 海藻酸钠载铜膜层, 比较四组试件的显微形态、湿润角、细胞相容性及抑菌性。 结果: 试件表面微孔、 裂纹数量, 甲组 > 乙组 > 丙组 > 丁组;细胞铺展面积, 丁组 > 丙组 > 乙组 > 甲组;各组试件的湿润角比较, 差异无统计学意义(P>0.05); 在大肠埃希菌培养液中培养 24 h 后,菌落数甲组 > 乙组 > 丙组 > 丁组,抑菌性丁组 > 丙组 > 乙组,差异均有统计学意义(P<0.05) 。 结论: 纯镁微弧氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠载铜膜层可有效封闭镁片表面微孔,且细胞相容性、抑菌性良好,效果优于纯镁微弧氧化层、纯 镁微弧氧化 - 壳聚糖复合膜层及纯镁微弧氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠膜层。

【关键词】 纯镁材料;微弧氧化;壳聚糖;海藻酸钠;铜膜层;抑菌性;细胞相容性


Analysis of cell compatibility and antibacterial activity of micro-arc oxidized pure Magnesium-chitosan/sodium alginate containing copper composite film
WANG Jingang1, YU Tingting2*
(1. Department of Oral and Maxillofacial Surgery of the Central Hospital of Jiamusi City, Jiamusi 154002 Heilongjiang, China;
2. Department of Prosthodontics of Stomatological Hospital of the Second Affiliated Hospital ofJiamusi University, Jiamusi 154002 Heilongjiang, China)
【Abstract 】 Objective: To analyze cell compatibility and antibacterial activity of micro-arc oxidized pure Magnesium chitosan/sodium alginate containing copper composite film. Methods: 20 test pieces were made of magnesium flakes with a purity of 99.9% and then were divided into 4 groups with 5 pieces each. The surface of group A was micro-arc oxidized pure Magnesium layer; the surface of group B was micro-arc oxidized pure Magnesium-chitosan composite film layer; the surface of group C was micro-arc oxidized pure Magnesium-chitosan/sodium alginate film layer; and the surface of group was micro-arc oxidized pure Magnesium chitosan/sodium alginate containing copper composite film layer. The microscopic morphology, the wetting angle, the cell compatibility and the antibacterial activity were compared among the four groups. Results: The number of micro-pores and cracks on the surface of the specimen: group A> group B> group C> group D; the cell spreading area: group D> group C> group B> group A. There was no significant difference in the wetting angle among the four groups (P>0.05). After culturing in Escherichia coli culture medium for 24 hours, the number of colonies was as follows: group A> group B> group C> group D; the antibacterial activity was as follows: group D> group C> group B; and the differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion: Micro-arc oxidized pure Magnesium chitosan/sodium alginate containing copper composite film can effectively seal the micropores on the surface of the Magnesium sheets, and has good cell compatibility and antibacterial properties. Moreover, it is superior to micro-arc oxidized pure Magnesium layer, micro-arc oxidized pure Magnesium-chitosan composite film layer and micro-arc oxidized pure Magnesium-chitosan/sodium alginate film layer.
【Key words】 Pure magnesium material; Micro-arc oxidation; Chitosan; Sodium alginate; Copper film layer; Antibacterial activity; Cell compatibility

纯镁是新型口腔种植材料,其密度和弹性模量 接近人体骨质,但不耐腐蚀,生物相容性差,需要进行表面处理以提高其生物性能。微弧氧化技术是 通过高温高压处理,使金属表面产生类似陶瓷的致 密氧化膜的技术 [1] ;而壳聚糖、海藻酸钠属于有机 材料,装载于纯镁表面可提高其耐腐蚀性和生物相 容性 [2-3] ;铜膜层则是在上述表面处理之后,用化 学方法在试件表面镀铜, 能够覆盖陶瓷膜上的微孔, 密闭性更好,从而起到更好的抑菌效果 [4] 。佳木斯市中心医院口腔颌面外科近年来开始探索纯镁微弧 氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠载铜膜层这一材料的应用 优势。本文比较 4 种涂层对纯镁材料细胞相容性和 抑菌性能的改善效果。


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1 资料与方法

1.1 仪器与材料 仪器:激光共聚焦显微镜(德 国卡尔 - 蔡司公司)、MGC-300H 恒温培养箱(上 海一恒科技有限公司)、灭菌锅(山东博科消毒设 备有限公司)、恒温水浴锅(常州市国旺仪器制造 有限公司)、JC2000C 接触角测定仪(上海坤诚科 学仪器有限公司)、双极性脉冲微弧氧化电源(哈 尔滨工业大学)。

试件材料:试件基底材料为纯度99.9% 的镁片, 将之切割为 10 mm&times;10 mm&times;1.5 mm 的长方形,共 20 片。

菌株:ATCC25922 大肠埃希菌(宁波泰斯拓 生物技术有限责任公司)、MC3T3-E1 小鼠前成骨 细胞(中科院上海细胞库)。

1.2 方法 (1)试件膜层制作。将镁片试件分为 甲、乙、丙、丁 4 组,每组 5 片。以金刚砂纸打磨 试件表面,以 10% 磷酸、8% 碳酸氢钠溶液依次进 行处理,清除表面沉积物。①甲组为空白对照组, 仅采用超声微弧氧化处理,以纯镁试件作为电源 阳极,装有硅酸盐电解液的不锈钢氧化槽为电源阴 极,微弧脉冲频率为 500 Hz,电压 300 V,辅助超 声的功率为 60 W,电压稳定后行 10 min 微弧氧化 处理, 之后将试件取出, 以蒸馏水冲洗, 晾干。②乙 组为纯镁微弧氧化 - 壳聚糖复合膜层:对纯镁试件 行微弧氧化处理后,用 0.12 mg/L NaOH 溶液浸泡1 h,取出晾干备用。取壳聚糖3 g,加入 1000 mL 1% 乙酸,超声振荡使壳聚糖溶解,将试件在壳聚糖溶 液中浸泡 6 h,使试件表面形成多糖薄膜。③丙组 为纯镁微弧氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠膜层,在乙组 基础上,将镁片试件在 0.15% 海藻酸钠水溶液浸泡
3 min, 取出后, 自然晾干。④丁组为纯镁微弧氧化- 壳聚糖 / 海藻酸钠载铜膜层组,经丙组方法处理 后,将试件放在载铜处理液中。载铜处理液配方:25 g/L NaH2PO4+20 g/L Na3PO4+8 g/L CuSO4 ·5H2O, 于 60℃下,浸泡 5 min,之后取出,将试件表面所 附液体去除,自然晾干。(2)膜层湿润角分析。将蒸馏水滴在试件表面, 用 JC2000c 接触角测量仪测定湿润角, 每组测 3 次, 取平均值。
(3)细胞相容性分析。将小鼠成骨细胞传代 培养 4 代,铺满培养皿的 80% 后,即开始试验。 将试件用酒精浸泡 24 h,蒸馏水冲洗后行紫外线 照射灭菌,重复 3 次。将试件放在 24 孔板底部, 37 ℃下培养 7 d,用 PBS 缓冲液冲洗 3 次,加入 无血清培养液、CCK-8 溶液混匀,继续培养 3 h (37 ℃), 采集上清液, 取酶标仪,在 450 nm 波 长处测定吸光度值。用激光共聚焦显微镜观察细胞 密度、细胞骨架蛋白及细胞形态,以碱性磷酸酶 (ALP)实验观察细胞活性。(4)抑菌性试验。用微量移液枪,将大肠埃 希菌在营养肉汤中稀释 10 倍,接种在培养基上, 恒温恒湿培养 24 h, 至菌落数为 500~1000 个 /mL。 之后将四组试件接种在培养基中,每个试件做 5 个平行组,向试件上滴加细菌稀释液,在恒温箱 中培养 24 h 后取出,以 2 mL 生理盐水进行冲洗, 采集 100 &mu;L 冲洗液,接种于培养基上再次培养 24 h,用自动计数仪检测菌落数。抑菌率 R=(m- n)/m&times;100%, 其中 m 为空白对照组(甲组)平均 回收的菌落数, n 为其他组平均回收的菌落数。

1.3 观察指标 (1)以显微镜观察四组试件表面 形态、细胞骨架, 以接触角测量仪测量湿润角。(2) 比较四组试件细胞相容性、抑菌试验结果。

1.4 统计学方法 采用 SPSS 20.0 统计学软件处理 数据,计量资料以(x—&plusmn;s)表示,采用 F 检验,以 P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组试件表面形态比较 显微镜下,甲组表面 呈多孔结构,表面凹凸不平,可见一些细小白色颗粒 和裂纹(图 1A) ;乙组(图 1B)、丙组(图 1C)孔 隙较小,裂纹逐渐消失;丁组表面未见孔隙和裂纹, 可见一层薄膜覆盖,多孔结构不明显(图 1D)。


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图 1 试件表面显微镜观察结果

2.2 各组试件湿润角比较 甲、乙、丙、丁组试 件表面湿润角依次为(69.50&plusmn;2.36) &deg;、(68.36 &plusmn; 4.26) &deg;、(68.05&plusmn;3.68) &deg;、(67.80&plusmn;2.77)&deg;, 四 组试 件的 湿润 角比 较,差 异无 统 计学 意义 (F=0.251,P=0.860)。

2.3 各组试件细胞相容性比较 使用显微镜观察小 鼠成骨细胞在试件表面铺展面积,甲组的铺展面积 较小,细胞核相对较小(图 2A) ;乙组的铺展面积 较甲组大, 成束张力丝显著增多, 黏着斑数量增多, 细胞核增大(图 2B) ;丙组细胞铺展面积进一步 增大,细胞多数为长梭形、多边形(图 2C);丁组细胞为多边形,细胞骨架丰富,黏着斑相对较多, 细胞核明显较其他三组都大(图 2D)。


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图 2 试件表面细胞相容性结果

2.4 各组试件抑菌性比较 培养 24 h 后,菌落数 甲组>乙组>丙组>丁组, 抑菌性丁组>丙组>乙组, 差异均有统计学意义( P<0.05)。 见表 1。


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3 讨论

纯镁材料行超声微弧氧化处理后,表面可形成 致密氧化镁层,但仍然会出现点蚀,表面在显微镜 下呈多孔形态,通过封孔材料,能够进一步改良其性能 [5] 。壳聚糖、海藻酸钠均是天然多糖类有机材 料,常用来封孔,两者具有很强的可塑性,且成膜 效果良好,壳聚糖本身具有较多正电荷,而海藻酸 钠具有较多负电荷,两者可以紧密结合 [6] 。本研究 结果显示,在显微镜下,甲组表面有多孔结构,乙 组及丙组孔隙较小,丁组表面未见孔隙,可见丁组 镀铜之后,纯镁微弧氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠载铜 膜层的表面最光滑平整。

本研究结果还显示,各组试件表面湿润角差 异无统计学意义,但丁组稍小于其他组,而且在小 鼠成骨细胞培养液中,丁组细胞铺展面积最大。分 析原因为,湿润角可影响细胞在试件上的亲附能 力。甲组膜层由共价键、氢键等维系,表面张力相 对较大,乙组、丙组中海藻酸钠、壳聚糖的存在, 可使膜层表面张力减小,丁组载铜之后,试件的表 面张力更小,更有利于细胞亲附,因此细胞相容性 最好 [7]。抑菌性试验结果显示,在大肠埃希菌培养液 中培养 24 h 后,菌落数甲组 > 乙组 > 丙组 > 丁组, 抑菌性丁组 > 丙组 > 乙组,可见丁组的抑菌效果最 好。这可能是因为,铜离子本身有一定抗菌效果, 而且铜膜层更致密、光滑,封闭性更好,因此其抑 菌效果优于其他材料 [8]。

综上所述,纯镁微弧氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠 载铜膜层可有效封闭镁片表面微孔, 且细胞相容性、 抑菌性良好,效果优于纯镁微弧氧化层、纯镁微弧 氧化 - 壳聚糖复合膜层及纯镁微弧氧化- 壳聚糖 / 海藻酸钠膜层。

参考文献

[1] 王欢,刘洋,戚孟春,等 . 微弧氧化技术制备钛基种植体表面涂层的研究进展 [J]. 国际口腔医学杂志, 2020,47(4): 6.
[2] 刘苗,赵雯,李德超,等 . 纯钛超声微弧氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠自组装种植体的动物实验研究 [J]. 口腔医学研究,2016, 32(7): 5.
[3] 郑玉婧,肖月,李慕勤,等 . 纯镁超声微弧氧化载人乳铁蛋白复合膜层植入体的生物相容性研究 [J]. 中国体视学与图像 分析, 2019,24( 1): 64-73.
[4] 刘继光,王丽萍,李慕勤,等 . 纯镁微弧氧化 - 壳聚糖 / 海藻酸钠载铜复合膜层制备及抑菌性 [J]. 表面技术,2016,45 ( 11): 8.
[5] 贾秋荣,崔红卫,张甜甜,等 . 不同电解液体系中高纯镁表面微弧氧化膜的组织与性能 [J]. 腐蚀与防护,2019(6): 391-395.
[6] 曹晖 . 基于微弧氧化 / 阴极沉积 Mg(OH) 2 膜层的镁合金疏水表面改性技术研究 [D]. 武汉:华南理工大学,2019.
[7] 何梦乔 . 纯钛微弧氧化 - 壳聚糖 - 海藻酸钠涂层的细胞相容性研究 [D]. 佳木斯:佳木斯大学, 2016.
[8] 王丽萍 . 纯镁微弧氧化—壳聚糖 / 海藻酸钠载铜膜层细胞相容性及抑菌性研究 [D]. 佳木斯: 佳木斯大学, 2017.

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来源:SCI论文网

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